У Самбірській хроніці вказано, що першу дерев’яну церкву в мурах міста було збудовано 1554 р. завдяки старанням Перемишльського єпископа Антонія (Радивилівського). Церква перетривала різні лихоліття аж до 1737 р. Сучасний храм Різдва Пресвятої Богородиці у Самборі споруджений 1738 р. за кошти Іллі та Олени Комарницьких, українських магнатів, власників багатьох самбірських сіл, що мали осідок в Радловичах (сучасна Ралівка). Збудований у стилі українського бароко, храм має форму хреста з однією банею.

У 1865 р. було змінено конструкцію церкви: за вівтарем збудували дугоподiбну захристiю, головний вівтар було перенесено, встановлено іконостас із царськими вратами. Деякі малярні роботи виконав маляр Яблонський (збереглася картина невідомого лицаря з підписом маляра).

У 1894–1895 рр. церкву було розписано всередині. Автором багатьох стінних образів був Корнило Устиянович.

Упродовж XIX – у першій половині ХХ ст. у церкві ще декілька разів проводили реконструкцію та ремонт. У 1935 р. під час ремонтно-реставраційних робіт під головним вівтарем було відкрито підземелля, в якому покояться тлінні останки фундаторів церкви Іллі та Олени Комарницьких, їхньої дочки Софії та Перемишльсько-Самбірського єпископа Атанасія (Шептицького), який помер у 1777 р. в с. Страшевичі біля Самбора.

Проводилися реставраційні роботи в церкві і в радянські часи, зокрема в 60-х та 80-х рр.

Протягом двох століть (за винятком незначного періоду на початку Першої світової війни та радянських часів) Протягом двох століть у храмі Різдва Пре-
святої Богородиці зберігається ікона Матері Божої, яку, за народним переказом, привезли зі Сходу два грецькі купці. Образ спершу зберігався в домі Йоана Стамовича, колишнього грецького купця, який поселився в Самборі, а потім – в Олени Добрянської. Саме в її домі на обличчі 15 вересня 1727 р. і з’явилися вперше криваві сльози. Ікона Богородиці з деякими перервами плакала кривавими сльозами упродовж дев’яти місяців. Того самого року, 3 грудня, єпископ Перемишльський, Саноцький, Самбірський Єронім (Устрицький) проголосив Самбірську ікону Пресвятої Богородиці чудотворною. Відтоді упродовж 11 років ікона знаходилася в дерев’яній церкві, збудованій ще 1554 р., а потім була перенесена до мурованого храму Різдва Пресвятої Богородиці.

Напередодні Першої світової війни ікона знову заплакала, її плач тривав дев’ять днів. З початком воєнних дій на території Галичини о. Франц Рабій, дослідник історії цієї ікони, вивіз її до Відня, а в 1915 р. повернув на попереднє місце. Папа Римський Пій ХІ завдяки клопотанням о. Ф. Рабія дав дозвіл на коронацію Самбірської чудотворної ікони Пресвятої Богородиці. Урочистість відбулася 26−28 серпня 1928 р. Акт коронації здійснив за дозволом Святішого Отця єпископ Йосафат (Коциловський).

В 1996 р. ікону реставрували в майстерні Львівського музею історії релігії (реставратор Василь Боянівський). Самбірська чудотворна ікона Пресвятої Богородиці після тривалої вимушеної перерви 23 лютого 1997 р. повернулася на головний престол церкви Різдва Пресвятої Богородиці.

Самбірська церква зберігає ще одну реліквію – мощі св. Валентина, якого стратили у 269 р. за те, що попри заборону римського імператора Юлія Клавдія ІІ таємно вінчав закоханих. Автентичність мощів (фрагмент черепа та кілька кісточок) підтверджує документ Папи Римського від 1759 р.